만성 독성 시험

만성독성시험은 대부분 실험동물의 생존 기간 또는 1세대 이상에서 실시하며, 관련된 중요한 시험으로는 만성독성, 발암성, 최기형 및 생식독성 등이 있습니다.

 

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1.  만성독성시험 및 발암성시험

 일반적으로 별도로 실시하지만 실험과정이 유사한 관계로 병합하여 실시합니다. 만성독성시험의 목적은 다양한 화학물질을 제한하고 독성을 확인하며 안전역을 설정하는 것입니다. 만성독성시험에 사용되는 실험동물은 2종이며, 그 중 1종은 설치류 흰쥐 또는 마우스 계통이어야 하며, 시험기간은 각각 22.5년과 12년입니다. 비설치류를 이용할 경우 개, 사람을 제외한 영장류나 흰담비 등 작은 육식동물을 이용할 수 있습니다.

만성독성시험도 시험물질을 사료에 섞거나 음료에 녹인 후 투여하지만, 특별한 사정이 있는 경우에는 위에 강제로 투여할 수도 있습니다. 시험에 사용되는 용량으로는 최대 허용 용량(MTD: maximum tolerance dose), 0.25MTD, 0.125MTD 등이 적용됩니다. 미국 환경청에 따르면 MTD는 “대조군 대비 10% 체중 감소를 일으키지 않는 최고 용량으로, 향후 사망, 임상 독성 징후, 자연 수명 단축이 예상되는 병리적 병변 등을 일으키지 않는 양”으로 정의됩니다. MTD는 아만성독성시험 자료를 활용해 외삽으로 산출할 수 있습니다.

동물의 사육 조건은 아만성독성시험과 동일하며, 만성시험에서 사용되는 종말점에는 외형, 눈, 사료 소비량, 체중, 임상현상, 행동변화, 혈액학, 혈액화학, 소변분석, 배설물분석, 장기 중량 및 조직 등의 자료가 포함됩니다. 일부 동물은 실험 기간 동안 특정 간격(6, 12, 18개월)으로 사망시켜 조직검사를 받습니다.

발암성 시험은 만성 및 아만성 독성시험에서 언급한 일반적인 조건(물리적 시설, 사료 등)을 일치시켜야 하며, 시간과 실험동물의 수를 고려하여 대부분 흰쥐나 마우스를 사용하지만 경우에 따라 비설치류도 사용됩니다. 시험물질은 동물의 이유기부터 평생(마우스는 1.5~2년, 흰쥐는 2년 이상)까지 투여하며, 용량은 일반적으로 MTD와 0.5MTD를 동시에 사용합니다. 종말점은 조직검사에서 관찰된 종양이며, 대조군의 자연 종양 발생률과 시험물질을 투여한 동물의 종양 발생률 간의 통계적 유의성을 확보하기 위해 충분한 수의 실험동물이 필요합니다. 일반적으로 한 종류의 동물에 대해 300마리 이상의 실험동물이 필요한데, 이는 MTD에서 암수 각 50마리, 0.5MTD에서 암수 각 50마리, 대조군에서 암수 각 50마리를 확보해야 하기 때문입니다.

 

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2. 생식독성시험과 최기형성 독성시험

전문가들 간에 의견이 일치하지 않아 시험방법을 간단히 설명하기 어렵습니다. 특히 최기형 시험 분야에서 사용되는 용어는 매우 전문적이고 광범위하여 연구팀마다 고유한 문제가 존재합니다. 현재 일반적으로 사용되는 대표적인 시험 네 가지는 다음과 같습니다:
① 1세대 생식력 및 일반 생식능 시험
② 다세대 생식력 및 일반 생식능 시험
③ 기형발생 시험
④ 임신 말기 및 수유기에 대한 영향 평가 시험

 

① 1세대 생식력 및 일반 생식능 시험은 전형적으로 수컷 20마리를 교배 60일 전에 시험물질로 처리하고, 암컷 20마리는 교배 14일 전에 처리합니다. 이는 정자 형성과 배란 시간을 일치시키기 위한 것으로, 교배 이후 암컷에 대한 처리는 임신 후 이유기까지 지속됩니다. 고용량은 과도한 모체 독성을 일으키지 않는 수준, 저용량은 사람에게 노출이 예상되는 수준 또는 독성을 일으키지 않는 조직 내 농도로 설정합니다.

독성 정도는 용량-반응 곡선을 통해 계산하고, 교배 여부는 질 분비물에서 정자 유무를 확인하거나 마우스의 경우 점액봉(vaginal plug)의 형성으로 확인할 수 있습니다. 암컷의 절반은 임신 중 해부하여 착상 전후의 태아 치사율을 평가하고, 나머지 절반은 출산 후 3~4일 후에 10마리의 새끼를 선별해 이유기 동안의 기형 여부를 조사합니다. 종말점 지표에는 착상 전 사망률, 착상 후 사망률, 생식계 전반의 영향, 임신 지속성, 새끼의 생존율, 체중, 성별, 형태학적 변이, 이유기 복부 이상, 생존 및 사망률, 체중 증가 등이 포함됩니다.

 

② 다세대 생식력 및 일반 생식능 시험은 일반적으로 흰쥐를 사용하며, F0세대에서 암수 모두 시험물질을 이유기부터 투여하고, 이를 F1 및 F2세대까지 연속적으로 이어갑니다. 고용량은 LD50의 약 1/10로 설정하며, 저용량은 아만성 독성시험에서 독성이 나타나지 않은 수준, 중용량은 그 중간값으로 설정합니다. 각 세대별로 용량군(대조군 포함)당 임신한 암컷이 최소 20마리 이상 있어야 하므로 충분한 수의 생존 개체를 확보해야 합니다. 종말점으로는 번식력, 교배율, 임신율, 총 출생 수와 생존 수, 성별, 출생 시 체중, 성장률, 조직학적 변화, 내부 장기 이상 등이 있습니다.

 

③ 기형발생 시험 은 구조적 기형 발생에 민감한 주요 장기 형성 시기에 국한하여 수행되며, 일반적으로 착상부터 분만까지 시험물질에 노출됩니다. 기형 발생 여부는 전 생애를 통해 평가할 수 있지만, 일반적으로 출산 직전에 확인합니다. 주요 종말점은 태아 치사율, 구조적 기형, 외형 기형, 연조직 및 골격 기형 등입니다.

시험 동물로는 보통 흰쥐가 사용되며, 경우에 따라 토끼도 사용됩니다. 설치류의 경우 임신한 암컷 20마리, 비설치류는 10마리 이상 확보해야 합니다. 고용량은 경미한 모계 독성을 보이거나 사망률이 10% 이하인 수준으로, 저용량은 모계 독성이 나타나지 않는 수준으로, 중간 용량은 두 용량의 중간 값으로 설정합니다.

시험물질 투여 기간은 주요 장기 형성 시기이며, 흰쥐 또는 마우스는 임신 615일, 토끼는 618일이 적절합니다. 시험 시작일은 흰쥐나 마우스는 질 내 정자 또는 점액봉이 관찰된 날, 토끼는 교배한 날로 설정합니다. 분만 전날 어미를 해부하여 착상 수, 흡수 부위, 태아 생사 여부, 난소의 황체 등을 조사하고, 태아의 1/3은 연조직 기형, 나머지 2/3는 골격 기형을 검사합니다. 비설치류는 모든 태아를 두 가지 검사에 사용합니다.

 

④ 임신 말기 및 수유기에 대한 영향 평가 시험 는 체중, 사료 소비량, 임상 증상, 장기 중량 등을 주요 지표로 하며, 배아·태아 독성은 태아 사망 수와 착상 수 및 흡수 부위로 판단합니다. 태아독성은 기형 외에도 모계독성, 스트레스, 기타 환경 요인에 따라 달라질 수 있으므로 용량 구분과 반복 시험이 필수입니다. 태아 수와 체중도 중요한 독성 지표로 사용되지만, 실험군 간 새끼 수의 차이로 인한 변이와 혼동하지 않도록 주의해야 합니다.