시험관 내 시험 및 기타 단기 시험

시험관 내 및 단기 독성시험은 화학물질이 게놈이나 세포변이에 미치는 영향을 평가하기 위한 목적으로 주로 동물 조직에서 분리된 세포를 대상으로 진행되는 실험 방식이다. 특히 단기 독성시험의 경우에는 실험 목적, 작용기전, 연구 방향의 유사성으로 인해 생체 내 시험과 시험관 내 시험을 병행하는 경우가 많다. 이는 시험관 내 시험이 화학물질의 발암 기전을 신속하게 파악할 수 있을 뿐만 아니라 발암성과 연관된 배아세포의 변이원성 여부, 변이된 유전자가 다음 세대에 미치는 유전 경향까지 정보를 제공하기 때문에 생체 내 시험 못지않게 중요하게 여겨진다. 화학적 발암의 첫 단계가 체세포 변이라는 이론은 이미 과학계에서 널리 인정되고 있으며, 변이원성과 발암성 간의 높은 연관성은 다양한 연구를 통해 입증된 바 있다. 이에 따라 다양한 화학물질의 조기 발암 가능성을 파악하기 위한 여러 시험법이 개발되었으며, 이 장에서는 대표적인 시험법과 그 특성에 대해 소개한다.

 

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1. 원핵세포 돌연변이 유발 시험

(1) Ames 시험은 Bruce Ames 교수가 개발한 것으로, 변이된 Salmonella typhimurium 균주를 이용하여 짧은 시간 내에 화학물질의 변이원성을 평가하는 시험법이다. 이 시험의 원리는 histidine을 합성할 수 없는 돌연변이 균주가 시험물질의 영향을 받아 유전자가 역변이됨으로써 histidine을 다시 합성할 수 있게 되는 현상을 측정하는 것이다. 정상 균주는 자체적으로 histidine을 합성하여 성장하지만, 변이 균주는 histidine이 존재하지 않으면 생존할 수 없고, 따라서 화학물질에 의해 야생형으로 회복된 균주만이 히스티딘 없는 배양기에서도 성장할 수 있다. 일반적으로 시험관 내 시험은 생체 내 시험에 비해 효소 활성이 낮아 독성 발생을 명확하게 확인하기 어렵다. 이를 해결하기 위해 PCB를 생쥐에 투여하여 P-450 효소를 유도한 뒤 간을 균질화하고, 포스트미토콘드리아 상등액(S-9 분획)을 분리하여 시험관에 첨가함으로써 대사활성을 보완한다. 이 S-9 분획은 화학물질이 대사되어 친전자성 물질을 형성하는 데 필요한 효소 작용을 극대화하는 역할을 한다. 사용되는 균주에는 Salmonella typhimurium 외에도 염기쌍 증감변이를 측정하는 TA-1531, 구조변환 변이를 측정하는 TA-1537, TA-1538, 그 외에 특이성은 떨어지지만 보편적으로 사용되는 TA-98, TA-100 등이 있다. Ames 시험 절차는 균주 현탁액에 보조 인자, S-9 분획, 시험물질, 액체 한천을 혼합하여 페트리 접시에 붓고 배양한 후, 히스티딘이 없는 조건에서도 성장한 역변이 콜로니의 수를 계수하여 결과를 분석한다. 확정시험은 다양한 농도에서 반복 실험을 거쳐 판정되며, 양성 대조군으로는 변이원성이 이미 입증된 물질을, 음성 대조군으로는 시험물질이 포함되지 않은 조건을 사용한다. 시험 결과는 통계 분석을 통해 유의미성이 검증될 때까지 반복 실험으로 확증해야 하며, 시험물질이 대사를 통해 활성화되어야만 변이원성을 나타내는지 여부를 확인하기 위해 S-9 분획을 제외한 실험도 병행되어야 한다. 수백 가지 화학물질이 이 시험으로 평가되었으며, 약 3분의 1 정도가 정량 분석에 적합하다는 결과가 보고되고 있다. Ames 시험은 변이원성과 발암성 간의 높은 상관관계를 기반으로 하며, 일부 예외적인 사례는 존재하지만 전반적으로 신뢰성 높은 결과를 제공한다.

(2) 대장균 역변이 시험은 Ames 시험과 유사한 방식으로, tryptophan을 합성할 수 없는 돌연변이 균주가 시험물질의 작용으로 야생형으로 변이되어 tryptophan을 다시 합성할 수 있는지를 평가하는 시험이다. 이 시험에서도 S-9 분획이 효소계 활성화 용도로 사용된다.

(3) Salmonella typhimurium 양성 변이 시험은 histidine 비필수 복귀균주에서 8-azaguanine 저항성 변이 균주의 출현 빈도를 측정하는 방식으로, 역변이 시험 못지않게 민감한 시험법으로 평가된다.

(4) 대장균 정변이 시험은 갈락토오스를 발효하지 못하는 돌연변이 대장균이 발효형으로 변이하거나 5-methyltryptophane 감수성 균주가 저항성 균주로 변이되는 정도를 평가하는 방식이다.

(5) DNA 복구 시험은 중합효소 결핍으로 인해 DNA 복구가 불가능한 대장균이 손상 물질에 더욱 민감하다는 원리에 근거하며, Bacillus subtilis를 이용한 재조합 시험에서도 동일한 논리가 적용된다.

 

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2. 진핵세포 돌연변이 유발 시험

(1) 포유동물 세포 변이 시험은 세포 배양 기술이 발전하면서 세포주를 이용한 독성 평가가 가능해졌으며, 1차 세포는 포유동물에서 직접 분리된 세포로 이상적이지만 배양이 어렵고 균일한 세포 분리가 어려워 실제 활용도는 낮은 편이다. 이에 따라 주로 세포주가 사용되며, 대표적으로 중국산 햄스터 난소세포와 생쥐 림프종 세포가 있다. 이들 세포주는 여러 세대에 걸쳐 배양이 가능하고 노화되지 않는 장점이 있으나, 화학물질에 대한 대사 활성이 낮아 시험에서의 민감도가 떨어지는 단점이 있다.

(2) 초파리 열성치사 시험은 초파리가 진핵세포를 갖고 있어 포유동물과 대사 메커니즘이 유사하다는 장점이 있으며 시험이 간편하다는 이점도 있다. 그러나 곤충은 포유동물과 달리 호르몬 체계, 면역 시스템, P-450 효소의 특성과 유도 능력이 다르기 때문에 정확성에는 제한이 따른다. 시험은 24시간 이내에 산란된 알에서 번식시킨 초파리 수컷에게 시험물질을 투여한 후, 암컷과 다양한 시점에서 교배시키고, F1 세대에서 다시 암수를 교배해 황체 유무를 기준으로 X염색체 변이를 판단한다. 교배 시점별로 정자세포의 단계별 손상 여부도 파악할 수 있다.

(3) 효모 변이 시험은 미생물인 효모를 이용해 주로 purine 생합성 경로에 관련된 효소 변이를 관찰한다. 효모는 P-450을 보유하고 있으나 포유류에 비해 특이성과 감수성이 떨어지기 때문에 S-9 분획을 추가해 대사 활성화를 보완한다.

(4) 마우스 변이 시험은 야생형 수컷 마우스에 시험물질을 투여한 후 열성 변이 특성을 지닌 암컷과 교배하여 F1 세대의 표현형에서 유전자 변이를 분석하는 방식이다. 이 시험은 자연 변이율이 낮고 정확도가 매우 높아 포유동물의 유전자 변이 예측에 유용하지만, 실험에 다수의 동물이 필요하다는 점에서 실용성에는 한계가 있다.