기타 단기 시험

1. DNA 손상 및 복구 시험

유전자 변이 시험, 염색체 손상 시험, 종양원성(oncogenicity) 시험에 주로 사용되는 다양한 종말점이 DNA 손상 여부나 화학물질에 의한 DNA 변이성을 판단하는 지표로 개발되었습니다. 그러나 이러한 대부분의 실험에는 DNA 변이 전후에 발생하는 대사 이상이 포함됩니다. 대표적인 테스트 방법은 계획되지 않은 DNA 합성 테스트(UDS; Unscheduled DNA Synthesis)입니다. UDS 시험은 DNA 손상 후 회복 정도를 측정하는 시험으로, 시험물질로 처리된 핵 내부에 3H-thymidine이 삽입되는 정도를 방사선 셀카법으로 측정해 회복 수준을 간접적으로 평가합니다. 이 시험은 간세포가 상당한 대사능력을 가지고 있어 DNA 수준의 변이를 측정할 수 있다는 장점이 있고, 변이원성 과정에서 발생하는 회복오류율과 정상 회복오류율을 명확하게 구분할 수 없다는 단점이 있습니다. 이러한 문제점을 보완하기 위해 변형된 방법을 이용하여 생체 내에서 계획되지 않은 DNA 합성을 측정하는 실험이 진행되고 있습니다.
DNA 손상을 평가하는 또 다른 방법은 시험 물질에 노출되어 발생하는 DNA 손상의 정도를 직접 평가하는 것입니다. 이때 DNA 분리 방법은 주로 알칼리 용출 방법 또는 자당 농도 차이를 이용한 원심 분리 방법을 사용합니다. 사용된 세포는 세포주나 간세포를 사용하며, 간세포는 체내 또는 시험관 내에서 처리하여 시험합니다. 효모를 사용한 재조합 시험과 중합효소가 결핍된 대장균 시험은 DNA 복구 관련 시험에도 적용될 수 있습니다.

 

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2. 염색체 이상 시험

염색체 이상시험은 소수의 유전자가 아닌 화학물질이 전체 염색체에 미치는 광범위한 독성을 평가하는 시험으로 염색체 절단이나 구성성분 교환 여부를 중심으로 진행됩니다.

(1) 자매염색분체교환시험(SCE; Sister Chromatid Exchange)은 염색체를 구성하는 자매염색분체 사이에서 발생하는 변이를 측정하는 시험으로, 각 염색분체의 동일한 위치에서 발생하므로 염색체 구성성분의 대칭적인 교환 형태를 가지고 있습니다. 최종 생성물은 정상 염색체와 형태학적으로 다르지 않으며, 엄밀히 말하면 염색체 이상이라기보다는 변이에 가깝습니다. SCE는 화학물질에 의해 쉽게 유도되기 때문에 종양 가능성과 유전독성 가능성 사이의 연관성이 높은 것으로 평가됩니다. 이 시험을 확인하는 대표적인 방법은 BDU(5'-bromo-2'-deoxyuridine)를 사용하여 세포를 2번의 DNA 복제 주기를 거쳐 분석하는 것입니다. 이때 세포를 형광색소로 염색한 후 자외선을 쬐면 BDU가 함유된 염색분체와 그렇지 않은 염색분체를 명확하게 구분할 수 있습니다. 참고로 대표적인 오염물질인 PCB 및 중금속에 오염된 텍사스 지역에 서식하는 들쥐 Peromyscus leucopus에서 발견되는 염색체 이상 사례도 존재합니다. 이 시험은 배양된 세포나 생체 내에서 처리된 동물 세포를 이용할 수 있는데, 특히 전자는 SCE 정도가 쥐들 사이에서 S-9 효소 시스템이 추출되었는지 여부에 따라 달라집니다. 생체 내에서 처리된 세포도 사용할 수 있다는 점에서 암 환자나 화학요법 치료 환자, 흡연자, 직업 노출 노동자의 림프구도 SCE 분석이 가능합니다. 또한, DNA 알킬화제와 발암촉진제(phorbolester) 확인에도 도움이 됩니다.

(2) 소핵실험(Micronucleus Test)은 일반적으로 마우스를 대상으로 생체 내에서 진행됩니다. 실험동물을 시험물질로 처리한 후 적혈구 간 세포를 골수로 염색하여 유사분열 말기 단계에서 염색체나 그 조각에 의해 생성된 소핵의 존재를 관찰합니다. 이 시험은 염색체를 파괴하거나 방추사의 기능에 영향을 미치는 화학물질 및 유사분열을 방해하는 물질의 독성 평가에 사용됩니다. 급성, 아만성, 만성 시험 등 사육 상태에 최적화된 암컷 쥐를 이종 교배시킨 후 LD50의 50% 또는 10% 농도로 시험물질을 처리합니다. 이후 몇 시간 간격으로 이틀간 동물을 죽이고 골수를 꺼내 슬라이드에서 건조하고 염색한 뒤 소핵의 존재 여부를 관찰합니다. 구현은 비교적 간단하지만 다른 테스트(SCE 등)에 비해 감도가 낮다는 단점이 있습니다.

(3) 설치류를 이용한 우성치사시험(Dominant Lethal Test)은 흰쥐, 쥐 또는 햄스터를 이용하여 변이원성물질의 생식독성을 결정하는 시험입니다. 시험물질로 처리된 수컷은 일정 기간 동안 매주 다른 암컷과 교미 후 교미된 암컷은 임신 2주 후 사망하여 황체의 존재 및 착상 배아의 수를 확인합니다. 우성 치사 변이 가능성을 판단하는 데 사용되는 종점은 수정지수(교미된 암컷 중 임신한 암컷의 비율), 착상 전 손실률(황체수 대비 착상 수), 총 임신한 암컷 중 사산한 태아 수, 총 착상 수 대비 죽은 태아 수 등입니다.

(4) 다른 관련 시험으로는 염색 후 현미경으로 다양한 세포의 염색체 이상을 관찰하는 방식이 있는데, 주로 사용되는 세포로는 중국산 햄스터 난소배양세포, 골수세포, 림프구 등이 있습니다. 관찰된 염색체의 비정상적인 형태에는 염색체 절단, 결손, 염색체 절단 및 결손, 단편화, 전위 및 배수체 증가가 포함됩니다.

 

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3. 포유동물 세포의 변이원성 및 발암성을 이용한 관련 규명 시험

이 실험은 태아 조직에서 분리된 섬유아세포를 배양하여 수행되었습니다. 초기 연구에서는 GH 생쥐의 섬유아세포를 발암물질로 처리한 뒤 세포 형태 변화, 성장 패턴 변화 등을 관찰했습니다. 변이원성과 발암성의 직접적인 관계는 이들 세포를 숙주동물에게 이식할 때 종양이 발생함을 확인할 수 있습니다. 최근에는 생쥐 태아에서 추출한 Balb/3T3와 C3H/10T1/2 두 가지 세포주를 이용하여 변이를 쉽게 확인할 수 있는 실용적인 검색 방법이 개발되었습니다.
실험 절차는 Balb/3T3 생쥐의 섬유아세포를 단층으로 배양하여 시험물질을 처리하는 것입니다. 시험물질은 세포 변이를 유도하여 변이된 세포가 단층에서 두꺼운 층(foci)으로 성장하도록 하고, 변이가 없는 세포는 분열을 멈추게 합니다. 예비시험 결과를 통해 시험물질의 투여범위를 정하고 고용량은 균체 형성을 50% 저해하는 수준으로 설정하고 저용량은 영향이 없는 수준으로 설정합니다. 시험물질을 세포에 1~3일 노출시킨 후 세척한 후 4주간 배양합니다. 단층으로 형성된 세포를 고정 및 염색하고 변형된 형태의 foci를 계수합니다.
이 테스트는 정량적 검증 단계에 도달하지는 않았지만 상당한 장점이 있습니다. 예를 들어 이식된 foci는 동일한 유전적 배경을 가진 숙주(congenichost)에서 종양을 유발하지만 변이가 일어나지 않은 세포는 그렇지 않습니다. Balb/3T3 및 C3H/10T1/2는 생체 내 발암 모델에서도 발암 촉진제에 대한 반응성이 높기 때문에 이 시험은 발암 촉진제를 식별하는 데 매우 유용합니다. 하지만 대부분의 세포주는 화학물질에 대한 대사활성이 없고, 대다수가 이수성(aneuploid)이기 때문에 미처리 조건에서도 발암 전구물질로 오인될 수 있어 실용상 한계가 있습니다.